PAPEL DE LA CALMODULINA, DE LA CALMODULINA QUINASA II Y DE LA CALCIUNEURINA EN LOS PROCESOS NEURODEGENERATIVOS RELACIONADOS CON LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

Investigador principal: Dr. Josep M. Tusell Puigbert
Institución: Institut d’Investigacions Biomèdiques de Barcelona. CSIC
Duración: 3 años

MEMORIA FINAL

1. Resumen

La microglía aparece asociada a placas seniles en la enfermedad de Alzheimer (AD) y podría intervenir directamente en la formación y en el desarrollo de la enfermedad neurodegenerativa. No se sabe si la reactividad microglial es un fenómeno resultante de la degeneración neuronal o si se trata de un acontecimiento inicial previo a la degeneración neuronal.

Experimentos previos realizados en nuestro laboratorio han permitido demostrar que se produce un fuerte incremento de calmodulina (CaM) y de calmodulina quinasa II (CaMK II) en la microglía reactiva del cerebro de ratones tratados con ácido caínico. ¿Qué papel tienen estas proteínas en la activación de la microglía? ¿Es, este incremento, indicativo de un papel fundamental de estas proteínas en el proceso de activación microglial?

La intervención farmacológica utilizando inhibidores específicos de estas proteínas, así como modelos experimentales adecuados, permitirán aclarar si estas proteínas tienen un papel fundamental y determinante en la activación microglial. El bloqueo o atenuación de la reacción microglial en el cerebro, en condiciones patológicas provocadas experimentalmente, permitirá valorar si disminuye la lesión neuronal o, por el contrario, queda agravada.

Además de la posible importancia de las células microgliales, debe considerarse que las características neuropatológicas del AD implican la pérdida selectiva de neuronas y la formación de placas seniles y de entramados (tangles) neurofibrilares. Estas placas y entramados tienen como componente principal la proteína amiloide (ß-AP) y la hipótesis que esta proteína es la responsable de la pérdida neuronal en la AD cada vez adquiere un mayor apoyo de la comunidad científica. La acción neurotóxica de la ß-AP se ha podido demostrar en diferentes tipos de cultivos celulares (neuronas corticales, de hipocampo y asimismo células PC12). Su acción neurotóxica está relacionada con un incremento de calcio en las neuronas. Por tanto, las proteínas que movilizan el calcio, como la CaM, pueden tener un papel muy importante en el control de esta neurodegeneración observada en el AD.

El objetivo fundamental de este proyecto ha sido, por una parte, establecer la función de la CaM en los procesos que conducen a la activación microglial (paso de microglía quiesciente a microglía reactiva) y en los procesos de muerte neuronal como respuesta a la degeneración neuronal relacionada con el AD. También ha sido objetivo del proyecto el estudio de la activación microglial inducida por péptidos amiloides.

 

2. Resultados

Proteínas implicadas en la homeostasis del calcio, como la CaM y la CaMK II, están involucradas en procesos tan importantes como la diferenciación celular y la transducción de señales producidos por agentes que inducen neurodegeneración y muerte celular. La CaMK II ha sido relacionada con muchas funciones neuronales. In vitro, la CaMK II fosforila un gran número de sustratos, proteínas y péptidos, como la sinapsina I, la tau, distintos receptores de glutamato y la proteína precursora amiloide (APP). Hemos estudiado la expresión de la CaMKIIa, de la CaMKIIß y de la calcineurina (CaN) en el cerebro de ratones administrados con ácido caínico. En las neuronas, hemos observado una disminución transitoria en la expresión de los ARN mensajeros de estas proteínas, tanto a las 5 como a las 24 horas de la administración del ácido caínico. El efecto desaparece a los 8 días. Estas modificaciones podrían ser producidas más bien por una hiperexcitabilidad neuronal inducida por el ácido caínico que por una degeneración neuronal, ya que no se han observado áreas con pérdida neuronal. Además, se ha encontrado un fuerte incremento de la CaMK II en las células microgliales reactivas. Este efecto que también ocurre en el caso de la CaM, no se produce con la CaN. Este hallazgo es muy interesante por el interés que tiene poder disponer de marcadores de glía reactiva, ya que una reacción glial se da como respuesta a estímulos que, en principio, son dañinos para las neuronas (Solà y col., 1998).

También se ha hecho el estudio comparativo de la expresión de la CaMK II y de la CaN en el cerebro de ratón. Se ha encontrado que la CaMK II y la CaN se expresan mayoritariamente en el córtex cerebral, el hipocampo y el estriado, y que valores más bajos se hallan en el cerebro medio y en el tronco cerebral. Los resultados muestran que ambas proteínas tienen una distribución muy parecida y abundante en la mayor parte de regiones cerebrales (Solà y col. 1999).

Además de los trabajos in vivo, se ha puesto a punto la metodología necesaria para poder obtener de forma adecuada cultivos de células gliales mixtas (astrocitos y microglía) y puros de cada uno de estos tipos celulares. A partir de los cultivos puros de microglía (ver fig. 1), hemos demostrado que cuando se activa la microglía con la toxina lipolisacárido (LPS) de Escherichia coli, la CaM no está implicada en los cambios de forma inducidos por LPS ni en la activación del óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) que dispara la toxina, pero sí que está implicada en la regulación de la proliferación de las células gliales inducida por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). De estos resultados puede concluirse que la CaM no está implicada en el aspecto de la activación glial referente a la producción de óxido nítrico (NO) ni en los cambios de forma producidos por LPS, pero en cambio, sí que está implicada en el otro aspecto relevante de la activación glial: el paso del estado de quiescencia al de activación proliferativa (Casal y col., 2001).

Figura 1
En el panel A se muestra el aspecto del cultivo mixto de astroglía y microglía, mientras que en el panel B aparece el cultivo puro de microglía. El marcado por inmunofluorescencia se realizó usando el anticuerpo de la GFAP para ver las células astrogliales y la lectina de tomate para visualizar las células microgliales. La barra equivale a 100 Ám.


Hemos utilizado un cultivo de células microgliales de rata de alto grado de pureza para observar los efectos que pueden tener los diferentes fragmentos amiloides sobre el paso del estado de quiescencia al de activación de estas células. Los fragmentos utilizados han sido el péptido Aß 1-42 (que es el más abundante en los cerebros de enfermos de AD) y el péptido Aß 25-35 (que contiene la secuencia de aminoácidos que se considera activa). Las células han sido tratadas a diferentes concentraciones de estos dos fragmentos en disolución, o haciéndolas crecer sobre películas de los fragmentos. El péptido Aß 1-42 hace incrementar de forma significativa la proliferación de la microglía y hace aumentar el número y la dimensión de las ramificaciones de las células, pero no induce la liberación de NO al medio de cultivo.



Figura 2
Inmunoreactividad al PCNA (marcador de proliferación celular) por efecto de los péptidos amiloides. Los paneles A y D muestran los cultivos microgliales no tratados a las 24 y 48 horas posteriores el sembrado, respectivamente. Los paneles B y E muestran los cultivos tratados con Aß 25-35 (24 y 48 h), mientras que los paneles C y F muestran los cultivos tratados con Aß 1-42 (24 y 48 h). Las flechas muestran células marcadas positivamente por inmunofluorescencia. La barra equivale a 20 Ám.


En cambio, el péptido Aß 25-35 no produce efectos claros de activación microglial, ya que no hace incrementar la proliferación, ni provoca ningún cambio morfológico, ni hace liberar NO al medio de cultivo. Por tanto, utilizando los cultivos puros de células microgliales, hemos demostrado que el péptido Aß 1-42 produce un aumento de la proliferación de las células gliales y, por tanto, es inductor de la activación glial. En cambio, el péptido Aß 25-35 no produce este efecto (ver fig. 2). La activación glial producida por el péptido Aß 1-42 puede ser debida al estado de agregación fibrilar, mientras que el péptido Aß 25-35 presenta un estado amorfo (ver fig. 3) (Casal y col., 2002).

Se ha demostrado que el estado de agregación en fibras de los péptidos amiloides se correlaciona de forma directa con su toxicidad. También se ha demostrado que el estado de agregación puede ser inhibido por péptidos cortos o péptidos antiagregantes. Estos péptidos han demostrado su eficacia tanto in vitro como in vivo. En este último caso, la administración intracraneal de estos tipos de péptidos en ratones que previamente habían sido tratados por la misma vía con el péptido Aß 1-42, demuestra una buena eficacia antiagregante y, por tanto, estos tipos de moléculas o las que puedan derivarse, pueden ser unos posibles buenos agentes antiagregantes. En nuestro laboratorio y en colaboración con el grupo dirigido por el Dr. Ernest Giralt del Departamento de Química Orgánica de la Universitat de Barcelona, grupo con experiencia probada en la síntesis de péptidos, estudiamos la eficacia antiagregante de una familia de péptidos sintéticos monometilados derivados del dominio central hidrofóbico del péptido Aß 1-42. Estos péptidos han sido diseñados buscando una capacidad disruptora de agregados tipo lámina ß. Los resultados que hemos obtenido hasta ahora demuestran que algunos péptidos de la serie tienen un efecto antiagregante que les permite inhibir el efecto tóxico inducido por el péptido Aß 1-42 en un modelo biológico basado en un cultivo de células PC 12 (ver fig. 4). El efecto antiagregante ha sido comprobado con microscopia electrónica (Rabanal y col., 2002).




Figura 3
Microscopia electrónica y estado de conformación en lámina ß de los péptidos. Los paneles A y B muestran el estado de conformación del Aß 25-35 y del Aß 1-42, respectivamente, por microscopia electrónica. Las flechas indican la agregación en lámina ß. La barra equivale a 0,1 Ám. El panel C muestra el estado de agregación relativo, determinado por la fluorescencia emitida usando la técnica de la tioflavina-T, los días 0, 3 y 7 del período de envejecimiento de los péptidos.






Figura 4
Efecto antiagregante de diferentes péptidos medidos como la capacidad de inhibición de la muerte celular inducida por el péptido ß 1-42 en un cultivo de la línea celular PC12.


Para caracterizar la influencia de la presencia de microglía o de astroglía en la producción de NO en cocultivos de ambos tipos celulares, hemos medido su producción, y hemos realizado estudios inmunocitoquímicos utilizando anticuerpos contra proteínas específicas de astroglía, de microglía y de la iNOS, responsable de la síntesis de NO. En los cultivos puros de astroglía tratados con LPS no vemos producción de NO o en muy poca cantidad. De todas formas, hemos comprobado,
realizando dobles marcados, que las pocas células inmunoreactivas para la iNOS que observamos en los cultivos de astroglía corresponden a células microgliales contaminantes (ver fig. 5). Por otra parte, haciendo cocultivos de microglía y de astroglía también hemos comprobado que para una misma cantidad de células microgliales, existe una producción mayor de NO en los cocultivos que en los cultivos puros de microglía.



Figura 5
Identificación de las células productoras de NO en un cultivo de células astrogliales. El panel A muestra el cultivo de astrocitos control marcado con anti GFAP (específico de astroglía). El panel B muestra un cultivo de astroglía tratado con LPS donde se observa el marcado rojo de GFAP y el verde de la iNOS. Se aprecia que los dos marcados colocalizan. El panel C muestra el marcado con OX-42 (específico de microglía) en un cultivo control de astroglía. Se observan algunas células de microglía que contaminan el cultivo de astroglía. El panel D muestra el doble marcado con OX-42 y con iNOS. La colocalización de ambos marcados demuestra que las células contaminantes son microgliales.


Es decir, existe una potenciación de la producción de NO en las células microgliales tratadas con LPS cuando éstas van acompañadas por células astrogliales. A través de la utilización de medios condicionados estamos estudiando la posibilidad que factores liberados por la astroglía sean responsables de esta potenciación (Solà y col., 2002).

 

3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos

Los estudios realizados en este proyecto han permitido avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares y celulares responsables de la actividad glial y de su implicación en el AD. Son, por tanto, estudios básicos con una clara orientación a la obtención de vías que permitan mejorar o evitar efectos tóxicos o inflamatorios que se producen en el cerebro de los enfermos de AD. Los resultados obtenidos con inhibidores de la CaM permiten sugerir que a través de esta vía no se podría anular la producción de nitritos, pero sí que se podría prevenir la proliferación microglial y, de forma indirecta, al existir menos microglía activa, disminuir su neurotoxicidad. Por otra parte, los estudios con antiagregantes han demostrado que algunos de éstos disminuyen significativamente la toxicidad que produce a las células PC 12 el péptido Aß 1-42. Hay que ver si ello también se produce en células neurales (neurona, glía) y asimismo, hay que diseñar nuevos antiagregantes que permitan cruzar la barrera hematoencefálica. En consecuencia, se espera que los resultados obtenidos constituyan una aportación tanto desde la vertiente celular como molecular para nuevas terapias para el AD.

 

4. Publicaciones y/o comunicaciones derivadas de esta investigación

Artículos
- Decreased expression of calmodulin kinase II and calcineurin messenger RNAs in themouse hippocampus after kainic acid-induced seizures
C. Solà, J. M. Tusell and J. Serratosa
J. Neurochem., 70: 1600-1608, 1998.

- Comparative study of the distribution of calmodulin kinase II and calcineurin in the mouse brain
C. Solà, J. M. Tusell and J. Serratosa
J. Neurosc. Res., 57: 651-662 (1999).

- The Ca 2+ /calmodulin signaling system in the neural response to excitability.
Involvement of neuronal and glial cells
C. Solá, S. Barrón, J. M. Tusell and J. Serratosa
Progress in Neurobiology,
58: 207-232 (1999).

- The Calcium/Calmodulin system in neuronal hyperexcitability
C. Solà, J.M. Tusell, J. Serratosa
Int. J. Biochem. Cell Biol., 3: 439-455 (2001).

- Role of calmodulin in the differentition/activation of microglial cells
C. Casal, J. M. Tusell and J. Serratosa
Brain Research., 902: 101-107 (2001).

- Relation between ß-AP peptides aggregation and microglial activation
C. Casal, J. Serratosa and J.M. Tusell
Brain Research, 928: 76-84 (2002).

- Astroglia potentiates the nitric oxide production by microglia
C. Solà, J. M. Tusell and J. Serratosa
Enviado a J. Neurochem.

- A study on the aggregational and toxicological properties of the 12-28 peptide fragment corresponding Alzheimer’s beta amyloid protein
F. Rabanal., M.R. Sastre, M.R. Quintero, J.M. Tusell, J. Serratosa, F. Albericio and E. Giralt.
Enviado a J. Peptide Sciences.

 

Comunicaciones
- Alteracions en l’expressió de calmodulina, de la quinasa II dependent de calmodulina i de la calcineurina a ratolins tractats amb àcid caínic. Resposta neural i glial.
Carme Solà, Josep Maria Tusell i Joan Serratosa.
II Simposi de Neurobiologia Experimental., Barcelona, Desembre de 1998.

- Implicació de la calmodulina en l’activació de la microglia de rata en cultiu.
Joan Serratosa, Carme Casal, Carme Solà i Josep Maria Tusell.
II Simposi de Neurobiologia Experimental., Barcelona, Desembre de 1998.

- Implicación de la calmodulina en los procesos de diferenciación. Activación y proliferación de las células microgliales.
Carme Casal, Josep M. Tusell y Joan Serratosa.
VIII Congreso de la Sociedad Española de Nerociencia.
Murcia, septiembre de 1999.

- L’astroglia potencia la producció de nitrit a la microglia.
C. Sola, J.M. Tusell, J. Serratosa.
III Simposi de Neurobiología Experimental.
Barcelona, diciembre de 2000.

- Relació entre els pèptids amiloides i l’activació de la microglia.
C. Casal, J. Serratosa i J. M. Tusell.
III Simposi de Neurobiología Experimental.
Barcelona, diciembre de 2000.

- Regulació de les proteïnes presenilina 1 i 2 per la proteína p21 in vivo.
S. Barrón, J.M. Tusell i J. Serratosa.
III Simposi de Neurobiología Experimental.
Barcelona, diciembre de 2000.

- Relación entre los péptidos amiloides y la activación glial.
C. Casal, J. Serratosa y J.M. Tusell.
IX Congreso de la Sociedad Española de Neurociencias.
Santiago de Compostela, septiembre de 2001.

- La producción de óxido nítrico en la microglía reactiva.
C. Solá, C. Casal, J.M. Tusell y J. Serratosa.
IX Congreso de la Sociedad Española de Neurociencias.
Santiago de Compostela, septiembre de 2001.

 


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